Het identificeren van bacteriën is een complex proces. Dit komt gedeeltelijk omdat er zoveel soorten-schattingen zijn van het aantal soorten van ongeveer 10.000 tot meer dan een miljard![1] Het correct kunnen identificeren van bacteriën is vooral belangrijk in klinische settings, omdat een geschikte behandeling kan afhangen van het type bacterie dat een infectie veroorzaakt. In de meeste gevallen is het identificeren van bacteriën een proces van eliminatie. Om bacteriën te identificeren, gebruikt u kleurtechnieken, noteert u het uiterlijk van de bacteriën en observeert u hoe de bacteriën reageren op verschillende omstandigheden. Om snel de exacte soorten bacteriën te bepalen, stuurt u een monster voor DNA-testen.

Methode één van de vier:
Bacteriën identificeren met Gramkleuring

  1. 1 Gebruik Gram-kleuring om te zien of bacteriën Gram-positief of Gram-negatief zijn. Gram-kleuring is een procedure waarmee u bacteriën in 2 veel voorkomende soorten kunt verdelen: Gram-positief en Gram-negatief. Gram-positieve bacteriën hebben een extra dikke celwand (gemaakt van een polymeer genaamd peptidoglycan) die een kleurstofvlek beter vasthoudt dan de dunnere celwanden van Gram-negatieve bacteriën.[2]
    • Veel voorkomende Gram-positieve bacteriesoorten zijn onder andere Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus en Listeria.[3]
    • Veel voorkomende Gram-negatieve bacteriesoorten zijn Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter en Fusobacterium.[4]
  2. 2 Gebruik veiligheidsmaatregelen. De bacteriën en chemicaliën die u tijdens een Gram-kleuringsprocedure gaat hanteren, kunnen allemaal gevaarlijk zijn. Draag een veiligheidsbril, nitrilhandschoenen voor eenmalig gebruik en een laboratoriumjas tijdens het uitvoeren van de vlek. Leg uw wegwerphandschoenen en andere verontreinigde afvalstoffen in een bio-gevaarlijke zak als u klaar bent. Volg de procedures van uw laboratorium voor het afvoeren van de biohazard-zak.[5]
  3. 3 Maak een dia van je bacteriemonster. Om het proces te starten, plaatst u een klein druppeltje of een stukje van uw bacteriemonster op een steriele glaasje. Leid de schuif 3 keer door de vlam van een bunsenbrander om het monster met warmte te fixeren.[6] Dit voorkomt dat het monster wegspoelt wanneer u reagentia toevoegt of de glaasje afspoelt.
  4. 4 Voeg 5 druppels kristal violet toe aan de dia. Plaats de druppels kristal violette kleurstof op de hitte gefixeerde cultuur. Laat het monster 1 minuut in de kristalviolette kleurstof weken.[7]
    • Om vlekken op uw hand te voorkomen, kunt u de schuif op zijn plaats houden met een wasknijper.[8]
  5. 5 Spoel de dia voorzichtig af om de vlek te verwijderen. Gebruik een zeer zachte stroom water uit een gootsteen of spuitfles. Spoel niet langer dan 5 seconden.[9] Dit proces verwijdert elke kleurstof die niet aan het monster is gebonden.
  6. 6 Voeg 5 druppels Gram-jodium toe aan de glaasje. Gram-jodium is een oplossing van jodium, kaliumjodide en natriumbicarbonaat.[10] Deze oplossing zorgt ervoor dat de kristalviolette kleurstof wordt gefuseerd met de celwanden van de bacteriën. Voeg ongeveer 5 druppels toe en laat het 1 minuut staan.[11]
  7. 7 Spoel het monster af met alcohol of aceton. Alcohol en aceton zijn ontkleuringsmiddelen. Als je bacteriën een Gram-negatieve stam zijn, zullen deze middelen de vlek verwijderen van de bacteriële celwanden. Laat een paar druppels ontkleuringsmiddel over het monster druppelen en laat het niet langer dan 3 seconden zitten. Spoel zachtjes met water gedurende niet meer dan 5 seconden om de alcohol of aceton te verwijderen.[12]
    • Als u het ontkleurende middel te lang op het monster laat zitten, kan het de vlek uit Gram-positieve bacteriën verwijderen, wat een vals Gram-negatief resultaat kan veroorzaken.
  8. 8 Tegen de oplossing met safranin. Safranin is een rode kleurstof, die als een tegenkleuring tegen het kristalviolet werkt en bacteriën verft die de violette vlek niet bevatten. Voeg ongeveer 5 druppels safranine-oplossing toe aan het monster en laat het 1 minuut staan. Spoel heel voorzichtig gedurende 5 seconden met water.[13]
  9. 9 Bekijk uw monster onder de microscoop met een vergroting van 1000X. Als de bacteriën een Gram-positieve stam zijn, zullen ze paars of violet onder de microscoop verschijnen. Gram-negatieve bacteriën zullen rood worden uit de safranin tegenkleuring.[14]

Methode twee van vier:
Met behulp van de Ziehl-Neelsen-beitstechniek

  1. 1 Gebruik Ziehl-Neelsen-kleuring om zuurvaste bacteriën te detecteren. Zure-snelle bacteriën bevatten een hogere hoeveelheid lipide dan andere soorten bacteriën, waardoor ze resistent zijn tegen de kleurstoffen die worden gebruikt bij Gram-kleuring. Zure-snelle bacteriën behoren tot het geslacht Mycobacterium, dat de bacterie omvat die tuberculose veroorzaakt (M. tuberculosis). Zure-snelle bacteriën kunnen worden gekleurd met een rode carbol-fuchsine kleurstof, die bestand is tegen uitspoeling met een zure alcohol of zwavelzuuroplossing.[15]
  2. 2 Neem de juiste veiligheidsmaatregelen. De chemicaliën en biologische materialen die worden gebruikt tijdens een Ziehl-Neelsen-kleuring kunnen gevaarlijk zijn. U zult ook warmtebronnen gebruiken, zoals een bunsenbrander, spirituslamp of elektrische schuifverwarming. Neem de volgende voorzorgsmaatregelen tijdens het uitvoeren van deze procedure:[16]
    • Draag een veiligheidsbril, nitrilhandschoenen en een laboratoriumjas.[17]
    • Zorg ervoor dat u geen dampen van de vlekken- en ontkleuringsoplossingen inademt of op uw huid of in uw ogen krijgt. Bewaar open containers onder een zuurkast.[18]
    • Wees uiterst voorzichtig bij het verwarmen van uw glaasje, omdat veel van de chemicaliën die u gaat gebruiken, ontvlambaar zijn. Er kunnen ook sporen van ontvlambare chemicaliën op diarekken en andere apparatuur zijn.[19]
  3. 3 Maak een dia. Spreid gelijkmatig een uitstrijkje van je monster over het midden van een steriele glijbaan, met cirkelvormige bewegingen. Uw uitstrijkje moet ongeveer 10 mm (0,4 inch) bij 20 mm (0,8 inch) zijn.[20]
  4. 4 Droog je dia. Plaats de dia op een droogrek met de opdruk naar boven. Laat het 30 minuten aan de lucht drogen.[21] Probeer niet om de dia droog te maken.
  5. 5 Verhit je uitstrijkje. U kunt het monster verwarmen door de schuif 2-3 keer met de bovenkant van het smeermiddel over de vlam van een bunsenbrander te bewegen.U kunt de schuif ook op een elektrische glijgordijn plaatsen op 65 ° -75 ° C (149 ° -167 ° F) gedurende minstens 2 uur.[22] Zorg ervoor dat u het monster niet verschroeit of kookt.
  6. 6 Voeg carbol-fuchsin-kleuring toe aan uw dia. Doe verschillende druppels carbol-fuchsine-oplossing op de glaasje. Voeg voldoende toe om het uitstrijkje volledig te bedekken.[23]
  7. 7 Verhit de gekleurde glaasje om de vlek op het uitstrijkje te fixeren. Verwarm de schuif voorzichtig over een bunsenbrander of spirituslamp met de smeerzijde naar boven of plaats deze op een elektrische glijverwarming. Verwarm de schuif totdat deze 60 ° C (140 ° F) bereikt. Je zou damp moeten zien opkomen. Laat de verwarmde vlek 5 minuten op de glijbaan liggen.[24]
    • Als u een elektrische diaverwarmer gebruikt, stelt u deze in op 60 ° C (140 ° F). Als u een bunsenbrander of spirituslamp gebruikt, moet u zorgvuldig op het uiterlijk van stoom of damp letten.
    • Om de dia gedurende 5 minuten op de gewenste temperatuur te houden, brengt u met tussenpozen warmte aan.[25]
    • Zorg ervoor dat u uw vlek niet opdroogt, verschroeit of volledig droogt.
  8. 8 Spoel de glaasjes af met koud water. Laat de glaasjes ongeveer 5 minuten afkoelen, spoel ze vervolgens heel voorzichtig een paar seconden met schoon water uit een kraan of knijpfles om vlekken te verwijderen die niet aan het monster zijn gebonden.[26]
  9. 9 Bedek het uitstrijkje met zure alcohol of zwavelzuur. Voeg voldoende 3% volume toe over volume (v / v) zure alcohol of 20% zwavelzuur om de uitstrijk volledig te bedekken. Laat het zuur op de glaasje glijden tot de vlek is vervaagd tot een zeer lichtroze.[27] Dit duurt meestal minstens 10 minuten.[28]
  10. 10 Spoel de dia schoon met schoon water. Spoel zachtjes met water uit een kraan of knijpfles, zorg ervoor dat je alle zuur en alle resterende sporen van kleurstof wegspoelt.[29]
  11. 11 Voeg tegenkleuring toe aan de dia. Zodra de dia is afgespoeld, bedek je je vlek met malachietgroen of Loeffler's methyleenblauwoplossing. Deze oplossingen creëren een groene of blauwe "achtergrond" die helpt de roodgeverfde bacteriën te onderscheiden, en zal ook elk ander biologisch materiaal op de glasplaat bevlekken (zoals menselijke cellen en bacteriën die niet zuurvast zijn). Laat de vlek 1-2 minuten staan.[30]
  12. 12 Spoel en droog de dia. Was de dia voorzichtig met schoon water om overtollige tegenkleuring te verwijderen. Als u klaar bent, veegt u de achterkant van de dia schoon met een schone doek en plaatst u de schuif op een rek om aan de lucht te laten drogen.[31]
  13. 13 Onderzoek de dia onder een microscoop met een vergroting van 1000X. Zure-snelle bacteriën moeten rood of warm roze verschijnen. Niet-zuurvaste bacteriën, niet-bacteriële cellen en de achtergrond zullen blauw of groen lijken.[32]

Methode drie van vier:
Bacteriële verschijning en gedrag observeren

  1. 1 Observeer de vorm van de bacteriën. Nadat u de kleuring hebt gebruikt om te bepalen of uw bacteriën Gram-positief, Gram-negatief of zuurvast zijn, wordt het tijd om het soort bacteriën te verfijnen. De eerste stap is het observeren van de vorm (en) van de bacteriën op de dia. De 3 meest voorkomende vormen zijn coccus (bolvormig), bacillus (staafvormig) en spiraal.[33]
    • Er zijn talloze variaties op al deze vormen. Coccus-bacteriën kunnen bijvoorbeeld in verschillende formaties voorkomen, zoals gefuseerde paren (diplococcus), ketens, clusters of groepen van 4 (tetrads).
  2. 2 Bepaal of de bacteriën aeroob of anaëroob zijn. Neem 2 monsters van de bacteriën en maak 2 afzonderlijke culturen. 1 cultuur moet anaeroob zijn (gegroeid zonder zuurstof) en de andere moet aerobisch zijn (gegroeid met zuurstof). Bewaar uw anaerobe cultuur in een zuurstofvrije omgeving bij 35 ° C (95 ° F) gedurende ten minste 48 uur voordat u de groei van bacteriën probeert te observeren.[34]
    • Als je bacteriën groeien in de zuurstofvrije omgeving, maar niet wanneer ze worden blootgesteld aan zuurstof, zijn ze anaëroob.
    • Bacteriën die groeien wanneer ze worden blootgesteld aan zuurstof, maar niet wanneer ze in een zuurstofvrije omgeving worden gehouden, zijn aerobisch.
    • Bacteriën die in beide omgevingen kunnen groeien, worden facultatieve anaëroben genoemd.
  3. 3 Doe een motiliteitstest om uit te vinden of uw bacteriën beweeglijk zijn. Beweegbare bacteriën kunnen zelfstandig bewegen door 1 of meer flagella te gebruiken om zichzelf voort te bewegen. Motiliteit, of gebrek aan beweeglijkheid, kan een belangrijke factor zijn bij het identificeren van een bacteriestam.[35] Er zijn verschillende soorten motiliteitstests, maar de halfvaste mediumtest is de veiligste en gemakkelijkst te lezen.
  4. 4 Creëer een cultuur voor je motiliteitstest. Bereid een cultuur van bacteriën in een voedingsbodem. Bereid de bouillon volgens de aanwijzingen voor uw favoriete bouillonmedium.[36]
  5. 5 Ent een buis van halfvaste beweeglijkheid agar met uw cultuur. Smeer een steriele inentingsnaald in met wat van de bouilloncultuur. Steek voorzichtig de naald recht in een tube halfvast agar geformuleerd voor motiliteitstesten (zoals TTC-agar). De naald moet ongeveer 2/3 van de weg naar de agar gaan.[37]
    • Als u klaar bent, trekt u voorzichtig de naald terug en zorgt u ervoor dat u de originele "steeklijn" niet doorbreekt.
    • Incubeer de buis gedurende 48 uur bij 30 ° C (86 ° F).[38]
  6. 6 Lees de resultaten van de motiliteitstest. Motiliteit agar wordt rood als het in contact komt met bacteriën. Als uw bacteriën beweeglijk zijn, zal een rode of roze kleur door de agar worden verspreid. Als ze niet-beweeglijk zijn, ziet u alleen de rode kleur langs de oorspronkelijke steeklijn.[39]

Methode vier van vier:
Alles samenvoegen

  1. 1 Zet je observaties samen. Om het genus van bacteriën te verkleinen, moet je de informatie van je vlekken, culturen en observaties van de bacterievorm combineren. Als u een cultuur van een patiënt test, kan informatie over hun symptomen ook nuttig zijn voor het verkleinen van het veld.[40]
    • Als uw testen bijvoorbeeld aantonen dat uw bacteriën Gram-negatieve, anaërobe, niet-beweeglijke bacillen zijn en ze worden geassocieerd met buikpijn, misselijkheid en braken bij de patiënt, zijn ze waarschijnlijk Bacteroides fragilis.[41]
  2. 2 Raadpleeg een database met bacteriën. Omdat er zoveel soorten bacteriën zijn, is het onmogelijk om ze allemaal alleen te onthouden of te herkennen. U zult waarschijnlijk een klinisch microbiologisch leerboek of een online database moeten raadplegen en zoeken naar bacteriën met alle kenmerken van uw monster.
    • Goede online bronnen voor het identificeren van bacteriën zijn het Pathosystems Resource Integration Center (patricbrc.org) en de Pathogenic Bacteria-database bij GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
  3. 3 Gebruik genetische tests om de exacte soorten bacteriën te bepalen. In sommige gevallen kan het nodig zijn om de exacte soorten bacteriën te identificeren. De snelste en meest effectieve manier om dit te doen is met DNA-testen. DNA-onderzoek is ook nuttig voor het identificeren van bacteriën die zich verzetten tegen traditionele vormen van kweken of vlekken.[42] Moderne microbiële DNA-testen kunnen heel snel worden gedaan, soms in slechts 2 uur.[43]
    • Als u geen toegang hebt tot een laboratorium dat microbiële genoomsequencing uitvoert, stuurt u een monster naar een gespecialiseerde faciliteit, zoals MIDI Labs of CD Genomics.