Het isoleren van cellen is een veelgebruikt proces dat in veel biologielessen en laboratoria wordt uitgevoerd. Omdat hartziekten wereldwijd prevaleren, bestuderen veel laboratoria momenteel het hart. Het isoleren van hartcellen is een eenvoudig proces dat gemakkelijk te leren is.

Deel een van de vijf:
De oplossingen voorbereiden

  1. 1 Maak een perfusiebuffer. De perfusiebuffer is de basis van alle oplossingen die worden gebruikt in het isolatieproces. De buffer bevat alleen toegevoegde glucose. De glucose verschaft een energiebron voor de cellen terwijl deze ex vivo zijn.
    • Meet 500 ml voorraad 1X perfusiebuffer (PB) in een maatcilinder.
    • Giet de PB in een bekerglas van 600 ml.
    • Voeg 0,500 gram glucose toe aan de oplossing.
    • Plaats de beker op een roerplaat.
    • Plaats een magnetische roerstaaf op de bodem van de beker.
    • Zet de roerplaat aan en roer de oplossing totdat alle glucose is opgelost.
  2. 2 Maak een stop-oplossing. Cellen zullen later in de "stopoplossing" worden geplaatst, waardoor het enzym verder wordt afgebroken door cellen af ​​te breken.
    • Scheid 18 mL PB in een valkbuis van 50 mL.
    • Voeg 2 ml Fetal Bovine Serum (FBS) toe aan de oplossing.
    • Voeg 25 ul van 10 mM CaCl2 aan de oplossing toe.
    • Draai de valk-buis driemaal heen en weer om de oplossing te mengen.
  3. 3 Maak een perfusie-oplossing. BDM is een brugremmer die voorkomt dat cellen samentrekken of kloppen en wordt gebruikt om de gezondheid en structuur van cellen te behouden. Perfusie-oplossing is perfusiebuffer met toegevoegd BDM.
    • Voeg in de resterende PB 0,463 gram 2,3-butadieenmonoxide (BDM) toe.
    • Roer de oplossing op een roerplaat totdat de BDM volledig is opgelost.
  4. 4 Maak een verteringsbuffer. Collagenase is een enzym dat collageen in het hart specifiek afbreekt, waardoor hartcellen uit het weefsel worden vrijgegeven.
    • Scheid 150 ml perfusieoplossing in een bekerglas van 250 ml.
    • Voeg 32 uL van 100 mM CaCl2 aan de oplossing toe.
    • Voeg 0,100 gram Type II Collagenase toe aan de oplossing.
    • Roer de oplossing op een roerplaat totdat het collagenase volledig is opgelost.

Deel twee van vijf:
De canulatie uitvoeren

  1. 1 Stel de canule in.
    • Maak een canule door een halve centimeter van de punt van een naald af te knippen.
    • Schroef de canule op de bodem van een spuit van 5 ml.
    • Vul de 5 ml-spuit met perfusieoplossing.
    • Vul een weegboot met perfusie-oplossing.
    • Plaats het uiteinde van de canule in de gevulde weegboot.
    • Maak twee afgeknipte hechtingen rond de onderkant van de canule.
  2. 2 Canuleer het hart. De aorta is de belangrijkste slagader van het hart die geoxygeneerd bloed aan de bloedsomloop levert.
    • Plaats met behulp van twee pincetten het uitgeholde rattenhart in de weegschaal.
    • Trek de aorta omhoog en over het uiteinde van de canule.
    • Bind twee hechtingen rond de aorta en maak het hart vast aan de canule.

Deel drie van vijf:
Een Langendorff-perfusie uitvoeren

  1. 1 Stel het Langendorff-systeem in. Het Langendorff-perfusiesysteem maakt gebruik van retrograde perfusie die vloeistof door de aorta naar het hart duwt, waar de digestbuffer hartweefsel afbreekt om cellen vrij te maken.
    • Vul een spuit van 60 ml met 50 ml perfusieoplossing.
    • Vul nog eens 60 ml spuit met 60 ml digestbuffer.
  2. 2 Perfusie van het hart. Het hart zou na de spijsvertering een lichte vleeskleur moeten hebben.
    • Schroef de canule op de bodem van het Langendorff-systeem.
    • Directe doorstroming van de perfusie-oplossing naar het hart totdat het hart druppels vrijmaakt.
    • Directe stroom van de digestbuffer naar het hart.
    • Houd de digestbuffer tot het hart zacht wordt, wat ongeveer 10 tot 12 minuten duurt.

Deel vier van vijf:
De dissectie uitvoeren

  1. 1 Verwijder het hart van de canule. De keramische gecoate schaar voorkomt membraan destabilisatie in het hart, wat kan leiden tot celdood.
    • Verwijder de canule van het perfusiesysteem en op een papieren handdoek.
    • Gebruik een met keramiek gecoate schaar en pincet om de bovenkant van het hart af te knippen en het uit de canule te verwijderen.
  2. 2 Verdeel het hart in drie delen.
    • Houd het hart vast met een pincet en gebruik een schaar om de rechterkamer (RV), intraventriculaire wand (IV) en linker ventrikel (LV) te snijden en te scheiden.
    • De LV zal het grootste stuk zijn en de RV zal het kleinste stuk zijn.

Deel Vijf van Vijf:
Isoleren van de cellen

  1. 1 Plaats de bekers in een waterbad. Het handhaven van een fysiologische temperatuur helpt voorkomen dat weefsel en cellen degraderen.
    • Vul zes bekers van 5 ml met 750 μL digestbuffer en plaats ze in een waterbad van 37 graden Celsius.
    • Label elk bekerglas op basis van de plaats in het hart waar het vandaan is gekomen, hetzij van de RV, IV of de LV. Er moeten 2 bekerglazen zijn voor elke RV, IV en LV.
  2. 2 Verwerven van de cellen. De troebelheid van de oplossing geeft aan dat cellen uit het weefsel zijn vrijgekomen.
    • Plaats elk stuk weefsel in een van zijn gelabelde bekers.
    • Gebruik een keramisch gecoate schaar om het weefsel voorzichtig uit elkaar te prikken.
    • Plaats een gesloten schaar in het midden van het weefsel.
    • Verplaats de schaarbladen naar een X-positie.
    • Herhaal de beweging door de bladen van links naar rechts uit te schuiven totdat de digestbuffer in de beker troebel wordt.
  3. 3 Breng de stukjes weefsel over naar de tweede set bekers.
    • Gebruik de met keramiek gecoate pincet om de geplaagde tissuestukjes over te brengen naar de tweede set gelabelde bekers.
  4. 4 Breng de cellen over naar een geëtiketteerde eppendorfbuis.
    • Label elke eppendorfbuis met RV, IV of LV. Er zullen 6 LV-buizen, 6 IV-buizen en 6 RV-buizen zijn voor een totaal van 18 buizen.
    • Vul elke eppendorfbuis met 750 μL stopoplossing.
    • Breng de oplossing van cellen over in de beker met digestiebuffer in een gelabelde buis.
  5. 5 Herhaal het proces. Vergeet niet dat er in totaal achttien tubes zullen worden gebruikt.
    • Herhaal Deel 5 stappen twee, drie en vier voor elk stuk weefsel zes keer.
  6. 6 Beëindig het isolatieproces.
    • Nadat u de cellen hebt overgebracht naar hun gelabelde eppendorf-buizen, is het celisolatieproces voltooid.
    • Gezonde hartcellen zullen recht zijn, lange staven met duidelijke strepen.
    • Dode cellen zullen verfrommeld en cirkelvormig zijn.