Hoe fosfaat gebufferde zoutoplossing te maken

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) is een zout mengsel dat wordt gebruikt in biologisch onderzoek. Het wordt gebruikt om een ​​groep cellen te verdunnen of cellen te scheiden. Deze buffer handhaaft een constante pH, zodat cellen niet worden vernietigd terwijl ze worden bekeken en opgeslagen. U kunt een 1X-oplossing maken die direct op cellen kan worden gebruikt of u kunt een 10X-voorraad maken die tot 1X kan worden verdund. Als uw laboratorium veel PBS gebruikt, is het misschien een goed idee om een ​​10X-voorraad te maken, omdat deze langer meegaat.

Methode één van de drie:
Een 1X voorraad maken

1. 1 Verzamel je materialen en ingrediënten. Om een ​​1X (de normale concentratie gebruikt voor experimenten) oplossing van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te maken, hebt u een cilinder met maat van 1 L, een balans, een bekerglas van 2 L, een roerstaaf, een roerplaat, een pH meter, een autoclaaf en een glazen fles voor opslag. Om 1 L PBS te maken, hebt u de volgende hoeveelheden van elk ingrediënt nodig:^[1]
   • Kleine hoeveelheden verdund HCl en / of NaOH om de uiteindelijke oplossing te pH
   • 800 ml gedestilleerd water
   • 8 g NaCl (natriumchloride)
   • 0,2 g KCl (kaliumchloride)
   • 1,44 g Na₂HPO₄ (dinatriumfosfaat)
   • 0,24 g KH₂PO₄ (monokaliumfosfaat)
   • De uiteindelijke concentraties van elke verbinding zouden 137 mm NaCl, 10 mM Na moeten zijn₂HPO₄1,8 mM KH₂PO₄2,7 mM KC1 en een pH 7,4.^[2]
2. 2 Plaats de roerstaaf in de beker en plaats de beker bovenop de roerplaat. Bij het maken van een oplossing wilt u de oplossing voortdurend in beweging houden. Dit zal helpen om alles sneller op te lossen. Om spatten te voorkomen als u eenmaal water hebt toegevoegd, plaatst u de roerstaaf in de lege beker en plaatst u deze boven op de roerplaat.^[3]
   • Een roerstaaf bevat een magneet waarmee de staaf kan draaien en de oplossing kan roeren wanneer een vloeistofcontainer op de roerschotel wordt geplaatst, die een motor bevat.^[4]
   • Wacht tot er een oplossing in het bekerglas zit voordat u het inschakelt.
3. 3 Meet 800 mL gedestilleerd water in het bekerglas van 2 L en zet de roerplaat aan. Begin bij het bereiden van een oplossing met minder dan het eindvolume water. Aan het einde voeg je de rest van het water toe om het totale volume op 1 liter te brengen. Meet met de maatcilinder 800 ml water en giet dit rechtstreeks in een schone beker.^[5]
   • Met het water in de beker zet u de roerplaat op gemiddelde snelheid aan. Je zou een kleine draaikolkvorm in het water moeten zien als de roerstaaf begint te draaien.
4. 4 Weeg de juiste hoeveelheden van elke chemische stof af. Weeg 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na af₂HPO₄en 0,24 g KH₂PO₄. Gebruik de balans om elke chemische stof afzonderlijk in een eigen weegboot te wegen.^[6]
   • Als je te veel van een chemische stof toevoegt, verwijder je het teveel totdat je de juiste hoeveelheid hebt.
5. 5 Voeg alle chemicaliën aan de oplossing toe en los op. Giet elke chemische stof in het water terwijl het roert. Er is geen speciale volgorde om ze toe te voegen, dus u kunt alles in één keer toevoegen. Laat alles blijven roeren totdat het volledig is opgelost.^[7]
   • Je kunt dit laten zitten terwijl je iets anders doet en het later controleren. Het duurt minimaal 5-10 minuten om op te lossen.
6. 6 Stel de pH van de oplossing in op 7,4. Zodra alles volledig is opgelost, moet je de pH van de buffer aanpassen totdat deze 7,4 is.^[8] Houd de roerstaaf op en plaats de pH-meter in de bovenkant van de oplossing. Laat de cijfers op de pH-meter stoppen met bewegen. De oplossing is waarschijnlijk te zuur, dus u moet natriumhydroxide (NaOH) toevoegen om de pH aan te passen.
   • Gebruik een kleine pipet om NaOH een paar druppels tegelijk toe te voegen. Laat na elke toevoeging de oplossing even roeren en controleer de nieuwe aflezing op de pH-meter.
   • Het aanpassen van de pH-waarde van een oplossing is een proces dat geduld vereist. Als u per ongeluk hoger dan 7,4 gaat, kunt u een paar druppels zoutzuur (HCl) toevoegen om het terug te brengen.
7. 7 Vul het water aan tot de oplossing 1 liter is. Nadat de pH goed is afgesteld, kunt u uw oplossing tot het eindvolume van 1 liter brengen. Giet de volledige oplossing voorzichtig uit de beker in de cilinder met maat 1-L. Voeg voldoende gedestilleerd water toe om er 1 L. van te maken.^[9]
   • Giet de uiteindelijke oplossing in een 1-L glazen fles veilig voor behandeling in een autoclaaf.
8. 8 Steriliseer de oplossing in een autoclaaf. Plaats het deksel op de fles, maar schroef het niet vast. Tijdens het autoclaveren kan de druk in de fles toenemen en exploderen als u het deksel aandraait. Plaats een strip autoclaaftape over het deksel om het op zijn plaats te houden tijdens het autoclaveren.^[10]
   • Stel de autoclaaf in om gedurende 20 minuten bij 15 psi op de vloeistofcyclus te steriliseren.^[11]
   • Autoclaaftape heeft hierin een temperatuurindicator. Als de autoclaaftape niet zwart wordt wanneer het proces is voltooid, is de autoclaaf niet heet genoeg geworden en moet u opnieuw steriliseren.
9. 9 Bewaar PBS op kamertemperatuur. Laat de PBS na het autoclaveren afkoelen tot kamertemperatuur en haal dan het deksel aan om de verontreinigingen buiten te houden. Als het deksel wordt vastgedraaid voordat de fles afkoelt, kan er een vacuüm ontstaan ​​en is het erg moeilijk om het deksel later te verwijderen. PBS is stabiel bij kamertemperatuur.^[12]
   • U kunt de PBS ook verdelen in kleinere containers om ze een voor een te gebruiken.

Methode twee van drie:
Een 10X aandelen maken

1. 1 Verzamel je materialen en ingrediënten. Het maken van de 10X (tien keer de normale concentratie gebruikt) voorraad is bijna identiek aan het maken van de 1X voorraad, je voegt gewoon 10 keer de hoeveelheid chemicaliën toe. Om de 10X-bouillon te maken, heeft u een cilinder met maat van 1 l, een balans, een bekerglas van 2 l, een roerstaaf, een roerplaat, een pH-meter, een autoclaaf en een glazen fles nodig voor opslag.^[13] Om 1-L te maken, hebt u de volgende hoeveelheden van elke verbinding nodig:^[14]
   • 700 ml gedestilleerd water
   • 80 g NaCl (natriumchloride)
   • 2 g KCl (kaliumchloride)
   • 14,4 g Na₂HPO₄ (dinatriumfosfaat)
   • 2,4 g KH₂PO₄ (monokaliumfosfaat)
   • Je hebt ook kleine hoeveelheden HCl en / of NaOH nodig om de uiteindelijke oplossing op pH te brengen.
   • De eindconcentraties van elke verbinding in de 10X-oplossing zijn 1,37 M NaCl, 27 mM KC1, 100 mM Na₂HPO₄en 18 mM KH₂PO₄.
2. 2 Plaats het bekerglas op de roerplaat en voeg de roerstaaf toe. Om alles snel op te lossen, gebruikt u een roerstaafje en roerplaat om de oplossing constant in beweging te houden. Plaats de roerstaaf in de lege beker voordat u begint om spatten te voorkomen.^[15]
   • Wacht tot er oplossing in het bekerglas zit voordat u de roerschotel indraait.
3. 3 Meet 700 mL gedestilleerd water af in het bekerglas van 2 L en zet vervolgens de roerplaat aan. U wilt beginnen met minder dan het laatste volume, omdat het volume zal veranderen als u de componenten eraan toevoegt. Nadat alles is toegevoegd en opgelost, voegt u de rest van het water toe om het totale volume op maximaal 1 L te brengen. Meet 700 ml water met de maatcilinder en giet dit direct in een schone beker.^[16]
   • Zodra water is toegevoegd, zet u de roerplaat op een gemiddelde snelheid aan. Je zou een kleine draaikolkvorm in het water moeten zien als de roerstaaf begint te draaien.
4. 4 Weeg de juiste hoeveelheden van elke chemische stof af. Weeg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na af₂HPO₄en 2,4 g KH₂PO₄. Weeg elke chemische stof afzonderlijk af in hun eigen gewichtschip.^[17]
   • Als je te veel van een chemische stof toevoegt, verwijder je het teveel totdat je de juiste hoeveelheid hebt.
5. 5 Los alle chemicaliën in de oplossing op. Voeg elke chemische stof toe aan het water terwijl het roert. Er is geen speciale volgorde om ze toe te voegen, dus u kunt alles in één keer toevoegen. Blijf roeren tot al het poeder volledig is opgelost.^[18]
   • Het duurt minimaal 5-10 minuten om op te lossen, dus laat het roeren en controleer het later.
6. 6 Zorg ervoor dat de pH van de oplossing 7.4 is. Als alles volledig is opgelost, moet je de pH van de buffer controleren en deze op 7,4 instellen.^[19] Houd de roerstaaf aan en dompel de punt van de pH-meter onder in de oplossing. Laat de cijfers op de pH-meter stoppen met bewegen om de huidige pH te meten. De oplossing zal waarschijnlijk te zuur zijn, dus je moet natriumhydroxide (NaOH) toevoegen om het basischer te maken.
   • Gebruik een kleine pipet om NaOH een paar druppels tegelijk toe te voegen. Laat na elke toevoeging de oplossing even roeren en wacht tot de cijfers niet meer bewegen. Blijf NaOH toevoegen tot je 7,4 bereikt.
   • Om een ​​oplossing te pH is een proces dat geduld vereist. Als je per ongeluk hoger dan 7,4 gaat, kun je een paar druppels zoutzuur (HCl) toevoegen om het terug te brengen.
7. 7 Voeg water toe om het eindvolume 1 liter te maken. Breng de oplossing met de pH goed afgesteld tot het eindvolume van 1 liter. Giet de volledige oplossing voorzichtig uit de beker in de cilinder met maat 1-L. Voeg voldoende gedestilleerd water toe om er 1 L. van te maken.^[20]
   • Giet de uiteindelijke oplossing in een 1-L glazen fles veilig voor behandeling in een autoclaaf.
8. 8 Gebruik de autoclaaf om de oplossing te steriliseren. Plaats het deksel op de fles, maar schroef het niet helemaal naar beneden. Het autoclaafproces produceert stoom die een opeenhoping van druk in de fles kan veroorzaken. Als het deksel wordt aangedraaid, kan de fles exploderen. Gebruik een strook autoclaaftape over het deksel om het op zijn plaats te houden tijdens het autoclaveren.^[21]
   • Stel de autoclaaf in om gedurende 20 minuten bij 15 psi op de vloeistofcyclus te steriliseren.^[22]
   • Autoclaaftape heeft hierin een temperatuurindicator. Als het de juiste temperatuur bereikt, wordt de tape zwart. Als de tape niet zwart wordt, is de autoclaaf niet warm genoeg en moet u hem opnieuw steriliseren.
9. 9 Houd PBS bewaard bij kamertemperatuur. Laat de PBS na het autoclaveren volledig afkoelen voordat u het deksel aandraait. Als je het deksel vastdraait terwijl het nog heet is, kan het een vacuüm creëren waardoor het erg moeilijk wordt om het deksel later te verwijderen. PBS is stabiel op lange termijn bij kamertemperatuur.^[23]
   • U kunt de PBS ook verdelen in kleinere containers om ze een voor een te gebruiken.

Methode drie van drie:
Verdunnen van de 10X voorraad tot 1X

1. 1 Bepaal de hoeveelheid 1X-oplossing die u nodig hebt. Eerst moet je weten hoeveel 1X voorraad je wilt voordat je kunt berekenen hoeveel 10X voorraad je nodig hebt. Het te maken bedrag is afhankelijk van het type experiment dat u aan het doen bent.
   • Als je gewoon een aliquot van 1X voorraad nodig hebt om rond te hebben, maak dan ongeveer 500 ml. Je kunt deze 1X voorraad een tijdje gebruiken en zult het niet zo vaak hoeven maken.
2. 2 Bereken de benodigde hoeveelheid 10X voorraad. Om het benodigde aantal van 10X voorraden te berekenen, verdeelt u eenvoudig uw totale volume met 10.^[24] Vergeet niet dat om het juiste volume te krijgen, uw eenheden moeten overeenkomen: als het volume dat u maakt in milliliter is, is het volume dat u toevoegt, in milliliter.
   • Bijvoorbeeld: als u 500 ml oplossing wilt, verdeel dan 500 bij 10 en u krijgt 50 ml. U hebt 50 ml 10X voorraad nodig om 500 ml 1x te maken.
   • Bijvoorbeeld: als u 2 L oplossing wilt, verdeel dan 2/10 en u krijgt 0,2 L. U kunt dit omzetten naar ml door te vermenigvuldigen met 1000. U hebt 200 ml 10X voorraad nodig om 2 L van 1x te maken.
3. 3 Trek het 10X-volume af van het totale volume. Om de hoeveelheid water te bepalen die nodig is om de 10X voorraad te verdunnen, hoeft u alleen maar het berekende 10X volume af te trekken van het totale volume dat u wilt.^[25]
   • Bijvoorbeeld: om 500 ml te maken, hebt u 50 ml 10x voorraad nodig. Omdat 500 - 50 = 450, hebt u 450 ml gedestilleerd water nodig om de stam te verdunnen.
4. 4 Verdun de 10X-stock met gedestilleerd water. Gebruik de volumes die u hebt berekend, en voeg gedestilleerd water toe aan de 10X voorraad. U hebt nu een 1X voorraad PBS gemaakt.^[26]
   • Voeg bijvoorbeeld 50 ml 10x voorraad toe aan 450 ml gedestilleerd water om 1X PBS-voorraad te maken. Wervel de container om de oplossing te mengen.
5. 5 Controleer de pH van de 1X voorraad. Soms beïnvloedt het verdunningsproces de pH van de buffer. Het is verstandig om de pH van de 1X voorraad te controleren en na verdunning op 7,4 te houden.^[27]
   • Gebruik de pH-meter om de pH te meten en gebruik HCl of NaOH om de buffer te corrigeren tot een pH van 7,4.